游离脂肪酸(FFA)测试盒(测血清、动物组织、微生物、细胞)(分光光度法) 

注意事项：本试剂盒用于测定血清 、动物组织 、微生物 、细胞等样品类型，如需测定植物组织中FFA含量请查询货号 LE-1-137/LE-2-137

货号：LE-1-061

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

游离脂肪酸，也称为非酯化脂肪酸，在与白蛋白结合的血浆中循环。动物血液中的游离脂肪酸 (FFA ) 含量是一项重要的生理生化指标 。血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢 、糖代谢 、 内分泌功能有关，游离 脂肪酸的浓度会因为糖尿病 、重症肝障碍 、 甲状腺功能亢进等疾病而上升。

测定原理：

用有机溶剂萃取 FFA。含有 FFA 的有机液与三乙醇胺铜反应,在有机相中形成脂肪酸铜(铜皂) FFA 一 Cu。Cu 离子与显色液反应形成紫红色络合物。反应形成的颜色深浅与 Cu 离子浓度的关系符合朗伯一比尔 定律， 因此可利用此反应进行比色。

试剂盒的组成：

萃取液：液体 60 ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂一 ：液体 8 ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂一 ：液体 8 ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂 ×1 瓶，室温保存。

试剂四：液体 18 ml ×1 瓶，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、离心机 、可调式移液器 、玻璃比色皿 、蒸馏水。

样本前处理：

1、动物组织：按照动物组织质量（ g） ：萃取液ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 萃取液） ，进行冰浴匀浆 。震荡提取 15min，5000 rpm 4℃离心 5min，取有机相待测。

2、血清：吸取 50 μl 血清样本，加入 1 ml 萃取液，震荡提取 15 min 后，4℃,   5000 rpm 离心 5 min，取有机 相待测。

3、微生物 、细胞：按照细胞数量（ 10⁴ 个）：萃取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加 入 1 ml 萃取液）加入萃取液，冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 2 秒，间隔 3 秒 ，总时间 3min）； 震荡提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃离心 5min，取有机相待测。

注意：有机相待测液可能存在于上层，也可能存在于下层，注意观察，体积较多的那一层即为有机相待测液。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 550 nm。

2、工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V） ：试剂二（V） ：试剂三（m）= 1（ml） 1（ml） ： 0.66（g） 的比例充分混匀 。

（注意：现用现配 ，用多少配多少，在空瓶中配制 ，试剂盒中带有 4 个空 瓶 ，先将试剂一与试剂二混合 ，最后再加入试剂三粉剂）

3、测定管：吸取750μl样本，加入250μl工作液，盖紧后震荡20 min，4℃,   5000 rpm离心5 min，分层后取  600μl上层有机相，加入300μl试剂四，摇匀， 10 min后于玻璃比色皿中测定550 nm的吸光值，记为A测定。

4、空白管：吸取750μl萃取液，加入250μl工作液，盖紧后震荡20 min，4℃,   5000 rpm离心5 min，分层后   取600μl上层有机相，加入300μl试剂四，摇匀，10 min后于玻璃比色皿中测定550 nm的吸光值，记为A测定。 

空白管只需测一次 。△A=A测定-A空白

注意 ：

1、有机溶剂易挥发 ，加入比色皿后应尽快检测。

2、测定管中加入的样本即样本前处理中的有机相待测液。

FFA 含量计算：

标准曲线：y = 0.0322x - 0.0141      R² = 0.9985     x：棕榈酸标准品浓度（nmol/ml）

y：吸光值差值△A

1、血清 FFA 含量计算：

FFA 含量(μmol/ml)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V3×V1÷V2)÷ 1000 

=0.621×(△A+0.0141)

2、动物组织 、微生物 、细胞中FFA 含量计算：

（1）按样本质量计算

FFA 含量(μmol/g 鲜重)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷（W× V1÷V2）÷ 1000 

=0.031×(△A+0.0141)÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V1×Cpr)÷ 1000 

=0.031×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入样本体积，0.75 ml；V2：萃取液体积，1ml；V3：加入血清（浆）体积，0.05 ml；Cpr：样本蛋 白质浓度，mg/ml；W：动物组织样品质量，g；  1000： 1 μmol= 1000 nmol  。

注意事项：

1、蛋白含量不可直接用萃取液提取的有机相待测液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理盐水选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒。

2、试剂盒最低检出限为 20 nmol/ml。