考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-060

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在 595nm 处有最大吸收 峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品

离心机、可见分光光度计、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

标准品：500μg/mL×1 瓶，4℃保存，临用前用蒸馏水稀释为50μg/mL。

样品中可溶性蛋白质提取

1、液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~ 10的比例（建议称取约 0. 1g组织，加入 1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min ，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~ 1000：1的比例（建议500万细胞 加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w ，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g ，4℃ ,离心 10min ，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1、分光光度计预热30min ，蒸馏水调零。

2、空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，于595nm比色，10~20min 完成比色，记为A空白管。

3、标准管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL标准液，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，于595nm比色，10~20min 完成比色，记为A标准管。

4、测定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待测液，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，于595nm比色，10~20min完成比色，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

Cpr (µg/mL）=50×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) C 标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。

注意事项：

1、加考马斯亮蓝后，在 10~20min 内吸光值相对较稳定，因此须在 10~20min 完成比色。

2、不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用 95% 乙醇冲洗。

3、测定前用 1~2 个样做预实验，确保蛋白浓度在 0~ 1000µg/ml 范围内，否则需要做相应稀释，使得稀释 后的结果在  0~ 1000µg/ml 范围内，然后再乘以稀释倍数。