正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Pro 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增  加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此， 脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

测定原理：

用磺基水杨酸（SA）提取 Pro，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯 萃取后，在 520nm 测定吸光度。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、甲苯 50mL、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：冰乙酸 25 mL×1 瓶，4℃保存。（自备）

试剂二：液体 25 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：甲苯 50mL×1 瓶，4℃保存。（自备）

样品测定的准备：

1 、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；之后  置 90℃振荡提取 10min； 10000g，25℃离心 10min， 取上清，冷却后待测。

组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加 入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆； 之后置 90℃振荡提取 10min； 10000g，25℃离心 10min， 取上清，冷却后待测。

2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建  议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 提取液），充分混匀，之后置 90℃振荡提取 10 分钟，10000g， 25℃离心 10 分钟，取上清，冷却后待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：

（1）取 0.5mL 样本+0.5mL 试剂一+0.5mL 试剂二 于有盖试管中，置沸水浴中保温 30min（盖 紧，防止水分散失），每 10min 振荡一次。

（2）待冷却后，在试管中加入 1mL 试剂三，振荡 30s ，静置片刻，使色素转至试剂三中； 吸取 0.8mL-1mL 上层溶液于 1mL 玻璃比色皿中，于 520nm 波长处比色，记录吸光值 A。

Pro 含量计算：

1、典型回归方程 y = 0.0521x - 0.0021  (x 为脯氨酸含量，μg/mL；y 为吸光值 A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）

=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)

=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro 含量(µg/g 鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)

=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.0384×(A+0.0021)

V1 ：加入反应体系中样本体积，0.5mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆） 体积 ，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500 ：细菌或细胞总数， 500 万。

注意：最低检测限为 1μg/mL 或 1μg/g 鲜重或 0.01μg/mg prot