脂肪酸合成酶活性试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-138

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

FAS 是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 而生成长链脂肪酸。FAS 普遍 表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

测定原理：

FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成长链脂肪酸和 NADP⁺ ；NADPH 在 340nm 有吸收峰，而 NADP⁺ 没有；通过测定 340nm  光吸收下降速率，计算 FAS 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、 1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 10mL×1 瓶，－20℃保存。用前取出置于 4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1 瓶 ，4℃保存。临用前加入 275  μL 试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶 ，4℃保存。临用前加入 275  μL 试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 瓶 ，4℃保存。临用前加入 525  μL 试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。 12000g，4℃离心 40min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）： 试剂一体积（mL）为 500~1000： 1  的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 12000g，4℃,离心 40min， 取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

FAS 测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2、试剂四置于 40℃水浴中预热 30 min。

3、测定管：在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、20μL 试剂二、20μL 试剂三、820μL 试剂四和 40μL 试剂五，迅速混匀后于 340nm 处测定吸光值，记录第30s 和 90s 时吸光值， 分别记录为 A1 和 A2 。△A 测=A1-A2。

FAS 活性计算公式：

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADPH  为 1 个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(Cpr×V 样)÷T 

=1608×△A÷Cpr

2、按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADPH  为 1 个酶活单位。

FAS(nmol/min/g  鲜重) = (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=1608×△A ÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADPH  为 1 个酶活单位。

FAS(nmol /min/10⁴ cell) = (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 1608×△A ÷细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化 1nmol NADPH  为 1 个酶活单位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷V 样÷T

=1608×△A

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³/mol/cm； d：比色皿光径， 1 cm；V 反总：反应体系总 体积， 1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样：加入 反应体系中上清液体积， 100μL=0.1 mL；T：反应时间， 1min。