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产品名称:线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒

产品规格:50管/24样,100管/96样

产品货号:LE-1-302,LE-2-302

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-302

线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒

分光光度法

25/24

1280

LE-2-302

线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒

微量法

100/96

2500

线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书(分光光度法

货号:LE-1-302

正式实验前务必取2-3个预期差异较大的样本做与测定。

产品内容:

试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:0.5 mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂四:液体10mL×2 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×2 支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×2 支,-20℃保存;

产品说明:

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C 氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素C 的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色素C,因此550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 准确称取0.1g 组织或收集500 万细菌或细胞,加入1mL 试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆600g,4℃离心5min。

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL 试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10 秒,重复30 次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。

二、测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1) 工作液的配制:临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支,将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完,导致工作液失效。

(2) 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂4℃可保存一周;

(3) 1mL 玻璃比色皿中加入40μL 样本和800μL 工作液,立即混匀,记录550nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:ΔA 大于0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),使A1-A2 小于0.2,可提高检测灵敏度。

三、复合体Ⅳ活力单位的计算:

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=222×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.444×ΔA

V 反总:反应体系总体积,8.4×10-4 L;ε:细胞色素C 摩尔消光系数,1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。


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