线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-302

正式实验前务必取2-3个预期差异较大的样本做与测定。

产品内容：

试剂一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体10mL×2 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×2 支，-20℃保存；

产品说明：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C 的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 准确称取0.1g 组织或收集500 万细菌或细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆600g，4℃离心5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

二、测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完，导致工作液失效。

（2） 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂4℃可保存一周；

（3） 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL 样本和800μL 工作液，立即混匀，记录550nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：若ΔA 大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2 小于0.2，可提高检测灵敏度。

三、复合体Ⅳ活力单位的计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=222×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.444×ΔA

V 反总：反应体系总体积，8.4×10^-4 L；ε：细胞色素C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。