氨基比林-N-脱甲基酶（AND）活性测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-367

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素 P450 酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物,具有重要作用的酶系。AND 作为 P450 酶系的重要一员，相当于 CYP3A4 亚型,  与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理:

AND 催化氨基比林释放甲醛，通过 Nash 比色法测定甲醛含量，即可计算出 AND 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机、超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配制:

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶( 棕色瓶)，4℃避光保存。临用前加入 2.6 mL 无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 2.6 mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水 10mL 充分溶解。

试剂六：液体×1瓶，室温保存。

试剂七：液体×1瓶，4℃保存。

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取 1.5 mL EP 管, 加入 10µl 标准液, 加990µl 蒸馏水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液, 4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质: 称约 0.5g 组织, 加入 1 mL 试剂一，冰上充分研磨, 10 000g 4℃离心 30min，取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体: 4℃,100 000g，离心 60min , 弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质: 向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解, 100 000g 离心 30min , 弃上清液。

4、最终微粒体: 向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

AND 活性测定操作:

1、分光光度计预热 30 min,  调节波长到 412 nm, 蒸馏水调零。

2、试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3、对照管: 取 1 支 EP 管, 加入 50µL 粗酶液, 850µL 试剂二, 50µL 试剂三, 50µL 蒸馏水, 混匀后置于 37℃水浴保温 30min; 立即加入 175µL 试剂五, 混匀后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175µL 试剂六,  混匀后室温静置 5min; 室温 8000rpm 离心 5min; 取新的 EP 管, 加 入 500µL 上清液, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min, 然后取出,用冷水冷却 5min , 于 412nm 测定光吸收, 记为 A 对照管。

4、测定管: 取 1 支 EP 管, 加入 50µL 粗酶液, 850µL 试剂二, 50µL 试剂三, 50µL 试剂四, 混匀后置于 37℃水浴保温 30min; 立即加入 175µL 试剂五, 混匀后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175µL 试剂六,  混匀后室温静置 5min; 室温 8000rpm 离心 5min;  取 1 支新 EP 管,   加入 500µL 上清液, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷却 5min , 于 412nm 测定光吸收, 记为 A 测定管。

5、标准管: 取 1 支 EP 管,加入 500µL 标准品, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min , 然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm 测定光吸收,记为 A 标准管。

注意: 每个样品都需要做对照管。

AND 活性计算:

1、按照蛋白浓度计算:

活性单位定义: 37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

AND 活性(nmol/min/mg prot)= C 标准品×V 标准品×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管×稀 释倍数÷( Cpr×V 样) ÷T

= 45×( A 测定管 -A 空白管)÷A 标准管÷Cpr

2、按照样本质量计算:

活性单位定义: 37℃中每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

AND 活性(nmol/min/g  鲜重)= C 标准品×V 标准品×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管×稀 释倍数÷(W×V 样)÷T

= 45×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管÷W

C 标准品: 0.05 mmol/L=50µmol/L; V 标准品: 500µL=0.0005 L; 稀释倍数: V 反总÷V 上清 液= ( 50+850 +50+50+175+175) ÷500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白质浓度 mg/mL, 需要另外测定, 建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒; V 样: 加入粗酶液体积, 50µL=0.05mL; W: 样本质量, g  ; T:  反应时间, 30min。

注意事项:

1、粗酶液需在当日完成测定,如需保存,则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的 甘油,分装后, -80℃保存;

2、试剂三和试剂四需临用前配制,如当天没有用完, 4℃避光保存,可用 1 周;

3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定,建议用 BCA 法测蛋白含量。