货号：LE-1-368

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和  毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型，CYP2E1 不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多 种前致癌物和前毒物的活化过程。

测定原理：

AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通 过测定 630nm 吸光度增加速率，来计算AH 活性。

试剂盒的组成和配置：

试剂一：粉剂×1 瓶 ，4℃保存 。 临用前加入 50ml 蒸馏水，充分溶解。 

试剂二：液体×1 瓶 ，4℃保存 。

试剂三：粉剂×1 瓶 ，4℃保存 。 临用前加入 26ml 蒸馏水，充分溶解。 

试剂四：粉剂×1 瓶 ，4℃保存 。 临用前加入 13ml 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：液体×1 瓶 ，4℃保存 。

试剂六：粉剂×1 瓶（腐蚀性试剂） ，4℃避光保存 。临用前加入 26ml 蒸馏水，充分溶解。

试剂七：粉剂×1 瓶 ，4℃保存 。 临用前加入 26ml 蒸馏水充分溶解。

标准液：液体×1 瓶 ，10μmol/L，4℃避光保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、普通离心机 、超速离心机 、可调式移液枪 、 1ml 玻璃比色皿 、双蒸水和冰。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1ml 试剂一 ，冰上充分研磨，10 000g 4℃, 离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：  100 000g 4℃,   离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1ml 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃 上清液。

4、最终微粒体： 向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5ml，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。

测定操作：

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 630 nm，蒸馏水调零。

2、试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。

3、试剂五置于冰浴预冷 30min。

4、标准管：取 1.5ml EP 管，加入 500μl  标准液，500μl 试剂六，500μl 试剂七，混匀后室温静置 30min， 于 630 nm 测定光吸收，记为 A 标准管。

5、对照管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 试剂三，250μl 蒸馏水，混匀后 37℃水浴中保 温 30min；再加入 500μl 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃,  离心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 试剂六，500μl 试剂七，混匀后室温静置 30min，于 630 nm 测定光吸 收 ，记为 A 对照管。

6、测定管：取 1 支 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗酶液，500μl 试剂三，250μl 试剂四，混匀后 37℃水浴中保 温 30min；再加入 500μl 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃,   离心 10min；取 500μl 上清液，加入 1 支新的 1.5ml EP 管；再加入 500μl 试剂六，500μl 试剂七，混匀后室温静置 30min，于 630 nm 测定光吸 收 ，记为 A 测定管。

AH 活性计算公式：

1、按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T

= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr

2、按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。

AH 活性(nmol/min/g  鲜重)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T 

= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W

C 标准品： 10μmol/L；V 标准品：500μl=0.0005L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=1500μl÷500μl=3；Cpr： 粗酶液蛋白质浓度，mg/ml，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入反 应体系中粗酶液体积，250μl=0.25ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。