细胞色素 b5( Cytochrome b5)含量测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-370

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素 P450 和细胞色素 b5 是 P450 酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与 P450 代谢活性密切相关。

测定原理:

氧化型细胞色素 b5 经连二亚硫酸钠还原后，在 424nm 处有最大吸收峰，通过测定 424nm 和 490nm 处吸光值的差异，即可计算出细胞色素 b5 的含量。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、 1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存;

工作液配制: 临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二 50  mL 充分溶 解，4℃避光可保存 1 周。

样品中细胞色素 b5 提取:

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质: 称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃离心 30min ，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体: 100 000g，4℃离心 60min ，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质: 向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min ，弃上清液。

4、待测液: 向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解， 即待测液，该待测 液需当天测定。

细胞色素 b5 含量测定操作:

1、分光光度计预热 30 min。

2、工作液置于 25℃水浴中预热 30 min。

3、空白管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50  µ L 蒸馏水， 1000µ L 工作液，室温静置 2 min， 424nm 和490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 空白管 1 ，490nm 处吸光值记为 A 空白管 2 。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4、测定管:  取 1mL 玻璃比色皿，加入 50 µ L 待测液， 1000µ L 工作液，室温静置 2 min ， 424nm 和490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 测定管 1 ，490nm 处吸光值记为 A 测定 管 2 。△A 测定管= A 测定管 1- A 测定管 2。

注意:只需要做一个空白管。

样品细胞色素 b5 含量计算公式:

1、按照蛋白浓度计算:

细胞色素 b5 含量(nmol/mg prot)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷( Cpr×V 样) 

= 0.123×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

2、按照样本质量计算:

细胞色素 b5 含量(nmol/g 鲜重)=(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×( V 样总÷V 样)÷W

= 0.0614×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε: 还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数， 171×10^-3 L/nmol/cm; d:  比色皿光径(cm)， 1cm; V 反总: 反应体系总体积， 1.05 m L=0.00105 L; Cpr: 待测液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要 另外测定; V 样: 加入反应体系中待测液体积，50 µ L=0.05 mL; V 样总:  待测液总体积， 0.5 mL; W: 样品质量，g。