蔗糖磷酸化酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-288

测定意义

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷，

具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

测定原理

SP 能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP +生成 NADPH，导致340nm光吸收值增加。测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

缓冲液：液体 40mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 2mL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 1mL×1 支，4℃保存。

试剂四：粉剂 1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 5mL 双蒸水溶解。

试剂五：粉剂 1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 5mL 双蒸水溶解。

试剂六：粉剂 1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 10mL 双蒸水溶解。

试剂七：粉剂 1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 10mL 双蒸水溶解。

粗酶液提取

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表

SP  活性计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷（e×d）×V 反总÷V 样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/g）=△A÷（e×d）×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=804×△A÷W

3. 按照细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每10⁴个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=△A÷（e×d）×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量（万个）)÷T=804×△A÷细胞数量（万个）

e：NADPH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.2mL；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，2min

注意事项

1. 粉剂-20℃保存，配制好的试剂 3 天内使用完。

2. 可选用 BCA 法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。