货号：LE-1-231

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体9mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体50mL×1 瓶，4℃保存；

丙酮酸钠标准液，1mg/mL：液体1mL×1瓶，4℃保存。

产品说明：

丙酮酸通过乙酰CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、丙酮酸提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）： 提取液体积（ mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL  提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30 次），静置30min ，8000g ，常温离心 10min ，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆，静置30min ，8000g ，常温离心10min ，取上清待测。

3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置30min ，8000g ，常温离心10min ，取上清待测。

4、标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至100 、50 、25 、12.5 、6.25 、3.125 、1.5625 、0 g/ml。

二、测定步骤：

1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至520nm ，蒸馏水调零。

2、取300μL标准品或样本+100μL试剂一于1.5mLEP管中，混匀，静置2min ，加入500μL试剂二， 混匀，于520nm 波长处测定吸光值A。

三、丙酮酸含量计算：

1、根据标准品浓度和测定值建立标准曲线； y为丙酮酸钠含量（ μg/mL），x为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（ μg/mL）= (y×V1)÷ （V3×V1÷V2）=y×10

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量（ μg/mg prot）=(y×V1)÷(V1×Cpr)=y ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量（ μg/g 鲜重） = (y×V1)÷(W ×V1÷V2）=y÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量（ μg/10⁴ cell）＝(y×V1)÷（500×V1÷V2）= y÷500

V1：加入反应体系中样本体积，0.3mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500