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产品名称:海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-224,LE-2-224

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-224

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

分光光度法

50/48

1300

LE-2-224

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒

微量法

100管/96样

2200

海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS试剂盒说明书(可见分光光度法

测定意义:

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1  糖苷键连接而成的一种非还原双糖,广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外,它本身具有很强的吸水性,使它在生物体内具有抗脱水作用,在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、基因表达和代谢调节来保护植物免受不良环境的伤害。

植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖,该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)的作用下,催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖,再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 trehalose6-phosphate phosphatase,TPP)的作用下去磷酸化,生成海藻糖。因此,测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。

测定原理:

TPS 催化 UDPG  G6P 生成海藻糖-6-磷酸,同时产生 UDP;UDP 在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下,氧化 NADH 为 NAD+,NADH 的下降速率与 UDP 含量成正比,通过 340nm吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自备的仪器和用品:

分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 10mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后-20℃ 保存,禁止反复冻融;

试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入 25mL 试剂五溶解;现配现用;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存;临用前加入 0.1mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:100μL×1 瓶,4℃避光保存;临用前低速离心,以防止试剂沾在管壁; 试剂五:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

工作液的配制:临用前,先配置好试剂二和试剂三,然后取试剂二一瓶,加入 25μL 试剂三 25μL 试剂四,充分混匀,现配现用。

样品测定的准备

1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复30 次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织的处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),冰浴中匀浆。8000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、在EP 管中加入如下试剂

试剂名称(μL

测定管

样本

150

试剂一

150

混匀,30℃反应 20min,95℃水浴 2min 灭活,冷却至室温。10000g 4℃离心 5min,取上层反应液待测。

2、工作液配制:详见试剂的组成和配制中工作液的配制。

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下试剂

反应液

100

工作液

900

混匀,测定 340nm 5min 后吸光值 A1 10min 后吸光值 A2,ΔA=A1-A2。

TPS 活力计算:

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反总÷(ε×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T×3=643×ΔA ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/g  鲜重)=ΔA×V 反总÷(ε×d)×109÷(W× V 样÷V 样总)÷T×3=643×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/104 cell)=ΔA×V 反总÷(ε×d)×109÷(V 样×细胞数量)÷T×3=1.28×ΔA

V 反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.15 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;3,稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;细胞数量, 500 万。


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