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产品名称:果胶甲基反式消除酶(PMTE)测试盒

产品规格:50管/24样,100管/48样

产品货号:LE-1-329,LE-2-329

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-329

果胶甲基反式消除酶(PMTE)测试盒

紫外分光光度法

50/24

520

LE-2-329

果胶甲基反式消除酶(PMTE)测试盒

微量法

100管/48

1100

果胶甲基反式消除酶(PMTE)试剂盒说明书(紫外分光光度法

测定意义:

植物细胞壁是对抗病原真菌侵入的屏障,病原菌侵染植物过程中会分泌一系列细胞壁降解 酶,果胶甲基反式消除酶是一种细胞壁降解酶,在病原菌致病过程中具有重要作用。

测定原理:

PMTE 催化果胶反应释放出不饱和醛酸,不饱和醛酸在 232nm  有特征吸光值,通过测定 232nm 下吸光值增加速率反映酶活性。

需自备的仪器和用品:

分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 60mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂一:液体 40mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:液体 6mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂三:粉剂× 1 瓶, 4℃保存; 使用前加入 4mL 试剂一,60℃加热震荡溶解, 用不完的试 剂 4℃保存。

粗酶液提取:

1、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内, 离心后弃上清;按照细菌或细胞数量 104 个): 提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液) ,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、 组织: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。 12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测

测定步骤:

1  分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 232nm ,蒸馏水调零。

2 、 样本测定

1)工作液的配制:临用前按照样本数量,按以下比例配制工作液

试剂名称(μL)

测定工作液

对照工作液

试剂一

800

800

试剂二

200

 

蒸馏水

 

200

试剂三

50

50

2)按下表在 1mL 石英比色皿中加入如下试剂

试剂名称(μL)

测定管

对照管

样本

100

100

测定工作液

900

 

对照工作液

 

900

30℃避光孵育 30min 232nm 下测定吸光值 A 测定与 A 对照,△A=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

PMTE 活性计算:

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟释放 1 nmol 的不饱和醛酸定义为一个酶活力单位。

PMTE(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷  (ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T=72.5 ×△A÷Cp

2、按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟释放 1 nmol 的不饱和醛酸定义为一个酶活力单位。 

PMTE(nmol/min/g  鲜重) =[ΔA×V 反总÷  (ε×d×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T= 72.5 ×△A ÷W

3、按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟释放 1 nmol 的不饱和醛酸定义为一个酶活力单位。

PMTE(nmol/min/104 cell)= [ΔA×V 反总÷  (ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)×1000÷T = 0.145×△A

反总: 反应体系总体积, 1×10-3 L;ε :不饱和醛酸摩尔消光系数, 4.6×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径, 1cm;V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积, 1 mL;T: 反应时间,30  min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量, g;500:细菌或细胞 总数, 500 万。


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