亮氨酸氨基肽酶（LAP）试剂盒说明书（可见分光光度法）

测定意义：

LAP 是一类能水解肽链 N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝 、 肾 、胰等组织中，尤其以肝脏中含量  最为丰富 。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清 LAP 的活性均有不同程度的升高， 因此，血清 LAP 活性的 检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。

测定原理：

LAP 分解 L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在 405nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高 速率来计算LAP 活性。

试剂盒组成：

可见分光光度计 、 台式离心机 、水浴锅 、可调式移液器 、 1ml 玻璃比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1 、细菌 、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌 或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置 冰上待测。

组织：按照组织质量（ g） ：提取液体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 提 取液） ，进行冰浴匀浆 。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2 、血清（浆）样品：直接检测。

LAP 测定步骤：

1 、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

2 、将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可 50℃水浴加热约 30min 促进溶解）；在 37℃ （哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 250μl 样本和 750μl 试剂一 ，混匀后立即记录 405nm 处初始吸 光值 A1 和  2min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

若ΔA 大于 0.5 ，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数 。使 A2-A1 小于 0.5 ，可提高检测灵敏度。

LAP 活力单位的计算：

1 、血清（浆）LAP 活力的计算:

单位的定义：每 ml 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

 LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε ×d） × 10⁹]÷V 样÷T=205.8 ×ΔA

2 、组织 、细菌或细胞中LAP 活力的计算:

（ 1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol  对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε ×d） × 10⁹]÷(V 样×Cpr)  ÷T=205.8 ×ΔA÷Cpr 

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol  对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε ×d） × 10⁹]÷(W×  V 样÷V 样总)  ÷T=205.8 ×ΔA÷W 

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol  对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε ×d） × 10⁹]÷(2000×V 样÷V 样总)  ÷T=0.103×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1 × 10^-3  L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72× 10³ L / mol /cm；d：比色皿  光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.25 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。