产品名称:柠檬酸合酶(CS)试剂盒
产品规格:25管/24样,10管/9样,50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-A005-50,YX-C-A005-25,YX-C-A005-10,YX-C-A005
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-A005-50 |
柠檬酸合酶(CS)测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
3200 |
YX-C-A005-25 |
柠檬酸合酶(CS)测试盒 |
可见分光光度法 |
25管/24样 |
2000 |
YX-C-A005-10 |
柠檬酸合酶(CS)测试盒 |
可见分光光度法 |
10管/9样 |
1200 |
YX-C-A005 |
柠檬酸合酶(CS)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
6000 |
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。
测定原理:
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB转变成黄色的TNB,在412nm处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 1mL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)在试剂五中加入1mL无水乙醇和22mL试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;现配现用;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六,混匀,记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
CS 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T
=177.8×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.3556×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=355.6×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.711×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
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