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产品名称:柠檬酸合酶(CS)试剂盒

产品规格:25管/24样,10管/9样,50管/48样,100管/96样

产品货号:YX-C-A005-50,YX-C-A005-25,YX-C-A005-10,YX-C-A005

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

YX-C-A005-50

柠檬酸合酶(CS)测试盒

可见分光光度法

50/48

3200

YX-C-A005-25

柠檬酸合酶(CS)测试盒

可见分光光度法

25/24

2000

YX-C-A005-10

柠檬酸合酶(CS)测试盒

可见分光光度法

10/9

1200

YX-C-A005

柠檬酸合酶(CS)测试盒

微量法

100/96

6000

柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒说明书(微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

CSEC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环第一个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理:

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB转变成黄色的TNB,在412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 1mL 蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g4℃离心5min

③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。

⑤ 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)在试剂五中加入1mL无水乙醇和22mL试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;现配现用;

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六,混匀,记录412nm20秒时的初始吸光度A1220秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1

CS 活性计算:

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=177.8×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min/104cell=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.3556×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T

=355.6×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CSnmol/min /104cell=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.711×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104L/mol/cmd96孔板光径,0.5cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万。


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