糖原合成酶（Glycogen synthase，GCS）试剂盒说明书（微量法）
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GCS（EC 2.4.1.11）催化 UDPG 和葡萄糖残基生成糖原和 UTP，以 α -1，4-糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。

测定原理：

GCS 催化 UDPG 和葡萄糖残基生成糖原和 UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 GCS 活性。

自备实验用品及仪器：

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 18 mL×1 瓶， 4℃保存； 

试剂二：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂三：液体 16.4uL×1 支，4℃保存； 

试剂四：粉剂×1 支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1 支， -20℃保存；

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂五的配制：临用前在试剂五中加入 1mL 试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂五置于 37℃预热 5 分钟。

5、在 1mL 微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μ L 样本、10μ L 试剂五和 180μ L 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 Δ A=A1-A2。

注意：

在该试剂盒中，若Δ A 大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 Δ A 小于0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

GCS 活性计算：
用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GCS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε  ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×Δ A÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCS （ nmol/min/g 鲜 重 ） ＝ [Δ A×V 反总 ÷ （ ε ×d ） ×109]÷(W ×V 样 ÷V 样总)÷T=3215×Δ A÷W
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。GCS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε  ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×Δ A÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCS （ nmol/min/g 鲜 重 ） ＝ [Δ A×V 反总 ÷ （ ε ×d ） ×109]÷(W ×V 样 ÷V 样总)÷T=6430×Δ A÷W
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。