NAD 激酶（NAD kinase, NADK）试剂盒说明书（可见分光光度法）

规格：50 管/48 样

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成 NADP(H)。因此，NAD激酶在合成 NADP(H)

以及调节NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。

测定原理：

NADK催化NAD +磷酸化，生成 NADP+；NADP +可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH；NADPH 通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT），通过在600 nm下测定MTT的还原速度（吸光值的变化）可反映出NADK活性的大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂五：粉剂×1 瓶, -20℃保存；

样本测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，

加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 600nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在试剂三中加入16mL试剂一，充分混匀待用；现配现用。

工作液Ⅱ的配制：在试剂四中加入22mL试剂二，充分混匀待用；溶解后 4℃保存一周。

工作液Ⅲ的配制：在试剂五中加入22mL试剂二，充分混匀待用；溶解后 4℃保存一周。

4、加样表

充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min，立即煮沸2min（盖紧，防止水分散失）冰浴冷却，10000g，25℃离心 10min，取上清

加完试剂混匀后立即在 600nm下测定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分钟 30 秒时的吸光值 A2，计算△A= A2-A1

NADK 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.002463x +0.004；x 为 NADP 标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK（nmol/min /mg prot）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（V1×Cpr）÷T

=135.3×（△A - 0.004）÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK（nmol/min /g 鲜重）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷(W×V1÷V2）÷T

 =135.3×（△A - 0.004）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。

NADK（nmol/min /10 4 cell）=[406×（△A - 0.004）×V1]÷（500×V1÷V2）÷T

 =0.271×（△A -0.004）

V1：加入反应体系中样本体积，0.08mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g;；500：细胞或细菌总数，500 万。