α-半乳糖苷酶（ α-Galactosidase,α-GAL） 试剂盒说明书（可见分光光度法）

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半 乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL 对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅速 转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

测定原理：

α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通过测定吸光值升高速率来计算 α-GAL 活性。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂组成和配制：

提取液： 液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一： 粉剂×1 瓶，-20℃保存； 临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水，充分溶解备用； 用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二： 液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三： 液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清； 按照细菌或细胞数量（ 104  个） ：提取液体积（mL） 为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液） ， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次） ；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织： 按照组织质量（g） ：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂） ：

每个测定管需设一个对照管。

α -GAL 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y =0.32x-0.0027； x 为标准品浓度（nmol/mL） ，y 为吸光 值。

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义： 每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T =62.5× (ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义： 每 g 组织每小时产生 1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 α-GAL 活力(nmol/h/g 鲜重)＝ [(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=62.5× ( ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义： 每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.125× ( ΔA +0.0027)

       Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL； V 反总： 反应体系总体积，0.5mL； V 样： 加入反应体系中   样本体积，0.05mL； V 样总： 加入提取液体积，1mL； W： 样本质量，g；  500： 细胞或细菌总 数，500 万； T： 反应时间，0.5h。