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产品名称:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-349,LE-2-349

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价

LE-1-349

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

紫外分光光度法

50/48

850

LE-2-349

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

微量法

100/96

1600

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)试剂盒说明书(紫外分光光度法

测定意义:

PEPCK( EC4.1.1.32)广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中,催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的关键酶。

测定原理:

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 45 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:液体×1 支,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 支, -20℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

1、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3、 血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;现配现用;

试剂四的配制:临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存一周;

2、 将工作液和试剂四置于37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热5分钟。

3、 1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂四和900μL工作液,立即混匀,记录340nm 处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算 ΔA=A1-A2。

注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PEPCK 活性计算:

1、血清(浆)PEPCK 活力计算

单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=3215×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算

1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算

单位定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T

=3215×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每1万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T

=6.43×ΔA

V 反总:反应体系总体积,1×10-3L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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