磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-349

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PEPCK（EC 4.1.1.32 ）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸 ，是调节糖异生途径的关键酶。

测定原理：

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO₂ ，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺ ，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 45 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 41μL×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提  取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂四的配制：临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。

5、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本、50μL 试剂四和900μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值 A1 和  1min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A1-A2。

注意：

在该试剂盒中，若 ΔA 大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA 小 于 0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PEPCK 活性计算：

1、血清（浆）PEPCK 活力计算

单位定义 ：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷V 样÷T

=3215×ΔA

2、组织、细菌或细胞中PEPCK 活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T

=3215×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=6.43×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL； T： 反应时间， 1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。