异柠檬酸裂解酶（ICL）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格：50T/48S

产品内容：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存，临用前将试剂七加入到提取液中；

试剂一：液体 8mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 6mL 双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

试剂四：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 6mL 双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

试剂五：液体×2 支，4℃保存；临用前每支加入 400µL 双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂仍 4℃保存；

试剂六：粉剂×2 瓶，4℃保存；临用前每瓶加入 6mL 双蒸水，充分混匀待用；用不完的试剂 4℃ 保存。

试剂七：粉剂×1 支，4℃保存。

产品说明：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循环的关键酶之一。

ICL 催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在LDH 的作用下生成乙醇和NAD， NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，检测 340nm 吸光度的减小速率可间接反应 ICL 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品前处理：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入

1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g ，4℃，离心 20 分钟， 取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液配制：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=29:35:42:42:3 的比例将各试剂混合后备用。

3、样本测定

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加试剂六的同时开始计时，在 340nm 波长下记录10 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，计算∆A=A1-A2。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水， 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

三、ICL 活性计算：

1、组织中 ICL 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=∆A ÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样本×Cpr) ÷T=2297×∆A÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ICL（U/g 鲜重）=∆A ÷（ε×d）×V 反总×109÷(W÷V 提取×V 样本) ÷T=2297×∆A÷W

V 反总：反应总体积，1.0×10-3L；V 样本：加入样本体积，0.035mL；ε：NADH 摩尔消光系数， 6.22×103L/mol/cm；d：1mL 石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V 提取：加入提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

2、细菌或培养细胞中 ICL 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=∆A ÷（ε×d）×V 反总×109÷(V 样本×Cpr) ÷T=2297×∆A÷Cpr

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ICL（U/104 cell）=∆A ÷（ε×d）×V 反总×109÷(500÷V 提取×V 样本) ÷T=4.59×∆A

V 反总：反应总体积，1.0×10-3L；V 样本：加入样本体积，0.035mL；ε：NADH 摩尔消光系数， 6.22×103L/mol/cm；d：1mL 石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细菌或细胞数量，500 万；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。