乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-383

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP生成乙酰磷酸和 ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理：

（1）ACK 催化乙酸钠和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP

（2）丙酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生 成 ATP 和丙酮酸

（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD⁺ 

（4）在 340nm 下测定 NADH 氧化生成  NAD⁺ 速率，即可反映 ACK 活性

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL  石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.2mL×1 支，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配置：临用前取试剂二一瓶，加入 25mL 试剂一和 500μL 试剂三，充分混合 溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 样本和 900μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A1-A2。

ACK 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=536×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /g  鲜重）= [ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

=536×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=1.072×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。