苯胺-4-羟化酶（AH）活性测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型，CYP2E1 不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。

测定原理：

AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在 630nm 处有特征吸收峰；通过测定 630nm 吸光度增加速率，来计算 AH 活性。

自备实验用品及仪器：

普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、双蒸水和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 100mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂六：粉剂×1 瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入 10mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂七：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解。

标准液：液体×1 支，10μ mol/L，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10

000g 4℃，离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体： 100 000g 4℃，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 630 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。
3. 试剂五置于冰浴预冷 30min。
4. 标准管：取 0.5 mL EP 管，加入 100μ L 标准液，100μ L 试剂六，100μ L 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μ L 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为A 标准管。
5. 对照管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μ L 粗酶液，100μ L 试剂三，50μ L 蒸馏水，混匀后 37℃
水浴中保温 30min；再加入 100μ L 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃，离心 10min； 取 100μ L 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μ L 试剂六，100μ L 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μ L 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 对照管。
6. 测定管：取 0.5 mL EP 管，加入 50μ L 粗酶液，100μ L 试剂三，50μ L 试剂四，混匀后 37℃ 水浴中保温 30min；再加入 100μ L 试剂五，混匀后冰浴 5min，11000rpm，4℃，离心 10min； 取 100μ L 上清液，加入新的 0.5 mL EP 管；再加入 100μ L 试剂六，100μ L 试剂七，混匀后室温静置 30min，吸取 200μ L 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 测定光吸收，记为 A 测定管。
AH 活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g 鲜重)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
    C 标准品：10μ mol/L；V 标准品：100μ L=1×10-4L；稀释倍数： V 反总÷V 上清液=300μ L÷ 100μ  L=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中粗酶液体积， 50μ L=0.05 mL； T：催化反应时间（min），30min。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 2×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W
    C 标准品：10μ mol/L；V 标准品：100μ L=1×10-4L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=300μ L÷ 100μ  L=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒； W ：样品质量； V 样：加入反应体系中粗酶液体积，50μ L=0.05 mL； T： 催化反应时间（min），30min