正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm处测定NADH的减少量可反映GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体×1 支，4℃保存；

样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃(其

它物种)预热10分钟；现配现用。

（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂 4℃保存一周。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 样本、5μL试剂三和190μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1286×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1286×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=2.57×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10 ³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=2572×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=2572×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 GAPDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=5.144×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万