3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)试剂盒说明书（分光光度法-50管/48样）

测定意义

GAPDH 催化3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛、无机磷和 NAD，340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体×1 支，4℃保存；

一、样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10分钟；现配现用。

（2）在试剂三中加入1mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂 4℃保存一周。

（3）在1mL石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和950μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1072×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗 1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=1072×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V样总) ÷T

=2.14×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。