线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书(可见分光光度法)

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

线粒体复合体Ⅲ（EC1.10.2.2） 又称 CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型 CoQ 的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。

测定原理

与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂六：液体 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做）。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂 4℃可保存一周；

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、100μL 试剂六和 800μL 工作液，立即混匀，记录 550nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

复合体Ⅲ活力单位的计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T

=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总)

÷T=124×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.248×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9.4×10^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；

T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。