注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格：100T/96S

产品内容：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 130µL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存，用前 2.5mL 蒸馏水溶解。溶解后-20℃分装保存。

试剂六：液体 12.5µL×1 支，用前 0.25mL 蒸馏水稀释，4℃保存。

标准品：粉剂 10mg×1 支，4℃保存。

产品说明：

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH ，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还 原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5，5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid ，DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有最大光吸 收的特点，通过 2- 乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH ，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

自备仪器和用品：

分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板。

操作步骤：

一、样品的处理

（1）组织处理

新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0. 1g 。加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）； 然后加入 1mL 试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅 速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）； 8000g 4℃离心 10min；取上清液放置于 4℃待测，若暂 时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

（2）血液处理

血浆：将收集的抗凝血于 4℃ ，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的 试剂一，4℃ ，8000g 离心 10 分钟，将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试 可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

血细胞：将收集的抗凝血于 4℃，600g离心 10 分钟， 弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后 4℃放置 10 分钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

（3）细胞处理

收集不少于 106 个细胞， 首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加入 3 倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

二、实验操作：

1 、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm ，分光光度计蒸馏水调零。

2 、试剂二放置 37℃（哺乳动物） 或 25℃（一般物种） 水浴中保温 30min。

3 、标准品的稀释： 将标准品用 1mL 蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为 10mg/mL 。取适当溶液配制浓度 为25µg/mL 、20µg/mL 、12.5µg/mL 、6.25µg/mL 、3. 125µg/mL 、0µg/mL 的标准品（试剂一十倍稀释 后进行稀释）。

4 、取 0.5mL 离心管，加入 20µL 稀释好的标准品或样品，加入1µL试剂二，混匀后37℃孵育30 分钟。

5 、制作标准曲线

孵育完成后标准管依次加入 140µL 试剂三，20 µL 试剂四，20 µL 试剂五，2 µL 试剂六，迅速 混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2 。吸光度（A2-A1）为横坐标（x），浓度为纵 坐标（y）做标准曲线。

6 、样品管依次加入 140µL 试剂三，20 µL 试剂四，20 µL 试剂五，2 µL 试剂六，迅速混匀后，测定412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2 ，△A= A2- A1。

三、GSSG 含量计算

根据标准曲线，将样品△A 带入公式中（x），计算出样品浓度 y（ µg/mL）。 

（1） 按蛋白浓度计算

GSSG（µg/mg prot）=y×V  样÷(V  样×Cpr )=y÷Cpr

（2） 按样本质量计算

GSSG（µg/g 鲜重） = y×V  样÷(V  样÷V  样总×W)= y ÷W

（3） 按细胞数量计算

GSSG（µg/104 cell）= y×V  样÷(V  样÷V  样总×细胞数量)= y÷细胞数量

（4）按液体体积计算

      GSSG（µg/mL)=2y

V 样总： 上清液总体积，1 mL；V 样： 加入反应体系中上清液体积，20µL=0.02 mL；W：样品 质量，g  ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；细胞数量，以 106 单位计量； 2：血浆（血细胞） 稀 释一倍。

注意事项：

1 、样品处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。

2 、若不确定样品中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。

3 、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在 30 秒和 150 秒处完成读数。

4 、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。