乙酰乳酸合成酶（ALS）试剂盒说明书(微量法)

测定意义：

乙酰乳酸合成酶（Acetolactate Synthase），存在于植物生长过程中，它能以高度专一性和极 高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，从而影响支链氨基酸的生物合成。

测定原理：

ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸，乙酰乳酸在一定条件下脱羧生成乙偶姻，乙偶姻在碱性环境下与肌酸和α-萘酚反应生成红色物质，在 525nm 下有最大吸光值。 

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、硫酸铵、冰和蒸馏水。 

试剂的组成和配制：

缓冲液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶， -20℃避光保存；临用前加入 60mL 缓冲液充分溶解，用不完的试剂-20℃ 避光保存。

试剂二：30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶， -20℃避光保存；临用前加入 12mL 缓冲液溶解待用，用不完的试剂-20℃ 避光保存；

试剂四：1.5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：6mL×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×2 瓶， 4℃避光保存；临用前加入 3mL 试剂七溶解待用，现配现用。

试剂七：10mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液的提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：2~4 的比例（建议称取约 0.5g 到 1g 组织，加入 试剂一定容至 2mL），进行冰浴匀浆。17000g  4℃离心 20min 。取 1mL 上清，转移至新的 EP 管。

在取出的上清中加入约 0.5g 硫酸铵，充分溶解后 4℃静置 2h。然后 17000g    4℃离心 20min，弃掉上清。沉淀中加入 0.5mL 试剂二，充分溶解待用。用不完的样本-20℃保存。

测定步骤：

在 EP 管中加入如下试剂

充分混匀，60℃反应 15min，然后取 200μL 于 96 孔板中，测定 525nm 处初始吸光值 A 测定与 A 对照。ΔA=A 测定-A 对照。

ALS 活性计算：

标准曲线 y = 0.2438x - 0.0096 ，R²  = 0.997；其中 x 为标准品浓度，μmol/mL,y 为吸光值 ΔA

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的乙酰乳酸定义为一个酶活力单位。

ALS（nmol /min/mg prot）=  (ΔA+0.0096）÷0.2438×V 样÷(V 样×Cpr) ÷T×1000 

= 68.36×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 的乙酰乳酸定义为一个酶活力单位。

ALS（nmol /min/g 鲜重）= (ΔA+0.0096）÷0.2438×V 样÷(W ×V 样÷V 样总)÷T×1000 

= 68.36×ΔA÷W

V 样：加入样本体积，0.2 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。