谷氨酸脱氢酶（GDH）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-314

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GDH（EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

测定原理：

GDH 催化 NH4+ 、α-酮戊二酸和 NADH ，生成谷氨酸和 NAD+ ，引起 340nm 吸光度下降。通过测定 340nm 吸光度的下降速率，计算 GDH 活性。 

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）在试剂二中加入 25mL 试剂一充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物 种）水浴 5min；现配现用（配好后 12h 内用完）；

（2）取 0.05mL 样本和0.95mL 工作液于 1mL 比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时，在 340 nm 波长下记录20 秒时的初始吸光度A1 和5 分20 秒时的吸光度A2，计算 ΔA=A1-A2。

GDH 活性计算：

1、血清（浆） 中 GDH 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 

GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷V 样÷T

=643×ΔA

2、组织、细菌或细胞中GDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=643×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=643×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T

=1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。