货号：LE-1-342

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高 。ME 催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO₂ ，以及伴随 NAD(P)⁺ 的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与 生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME  活性测定较多， 已经成为抗氧化研究的热。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理：

NAD-ME 催化 NAD⁺ 还原成 NADH ，在 340nm 下测定 NADH 增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。；

试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；用时加 2mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；用时加 1mL 蒸馏水充分溶解备用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液 体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰 浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三和四置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上 。如果一次性测定 样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物 种）水浴 10min 以上（现配现用）。

3、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀，立即记录  340 nm 波长下初始吸光度 A1 和反应 1min 后 的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。

NAD-ME 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（ nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

= 4823×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（ nmol/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

= 4823×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（ nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=9.646×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL；T：反应时间， 1 min；Cpr：样本蛋白质  浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。