滤纸酶（FPA）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-119

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系，能水解纤维素β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖，研究滤纸酶活 力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。

测定原理：

滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在 540nm 处有最大光吸 收 ，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算得滤纸酶的活力。

试剂组成和配制

试剂一: 液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二: 液体 40mL×1 瓶，4℃保存。

滤纸条: 50mg×50 条。

自备仪器和用品：

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 ml 玻璃比色皿、恒温水浴锅。

酶液提取：

1、组织：按照质量（g） ：蒸馏水体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g，加入 1ml 蒸馏水）加入 蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃,   12000rpm 离心 10min，取上清置于冰上待测。

2、细胞：按照细胞数量（ 104 个） ：蒸馏水体积（ml） 为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃,  12000rpm 离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、培养液或其它液体：直接检测。

测定操作：

1、根据样本数量取两倍数量的滤纸条和 Ep 管，每支 Ep 管中放入一个卷状滤纸条(注意要 放入底部)，作为底物。

2、对照管：取 200μl 灭活的酶液，加入 500μl 试剂一 ，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为对照管。

3、测定管：取 200μl 酶液，加入 500μl 试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为测定管。

4、对照管和测定管同时置于 50℃水浴锅中反应 30min。

5、加入 800μl 试剂二，沸水浴 5min，自来水冷却后取 1ml 于 1ml 玻璃比色皿中测定 540nm 处吸光值，分 别记为 A 对照管和 A 测定管。

酶活性计算公式：

标准曲线：y = 0.2805x - 0.0255，R² = 0.9991

1、按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在 50℃,pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mg prot）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ Cpr

2、按照样本质量计算

酶活性定义：在 50℃, pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/g 鲜重）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ W

3、按液体体积计算

酶活性定义：在 50℃, pH4.6 条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/ml）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷V 样÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）

4、按细胞数量计算

酶活性定义：在 50℃, pH4.6 条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/10⁴cell）= (△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T 

= 0.891×(△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）

V 反总：反应总体积， 1.5ml，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2ml；V 样总：加入提取液体积， 1ml； Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

注意事项：

1、用干净的镊子取出滤纸条，带手套卷成卷放入 Ep 管底部。

2、样本灭活时保证同一批样本处理时间一致，建议沸水浴十分钟。

3、批量样本测定之前先做 1-2 个样本的预实验，若吸光值超过 1.2 ，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

4、显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。