二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明（分光光度法-25管/24样）

货号：LE-1-243

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4. 1. 1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2 的固定， 同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

测定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1 ，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO2 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢 酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的 变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应Rubisco 的活性。

需自备的仪器和用品：

可见-紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰 和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试 剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试 剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 1.25 mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试 剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。

粗酶液制备：

1、总Rubisco 酶提取：建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰 浴，200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定。 

2、②胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10  的比例（建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于4℃ , 200g 离心 5min， 弃沉淀，取上清在4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀 加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min）， 然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 Rubisco ，则按照步骤②提取粗酶液。

注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1 ：1 混合，用多少配多少；

（2） 在1mL 石英比色皿中加入 50uL 样本、50uL 试剂四和 900uL 工作液，混匀，立即记 录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2 ，计算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷  (ε×d） ×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g  鲜重）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T

=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符含义：

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反 应时间，5 min；W：样本质量，g。