NADPH-细胞色素 C 还原酶活性测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-366

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR 作为 P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。

测定原理:

NCR 催化 NADPH 还原氧化型细胞色素 c 生成还原型细胞色素 c，还原型细胞色素 c 在 550nm 处有特征吸收峰;通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来计算 NCR 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、 1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前配制，加 2.6 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前配制，加 550 µL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核和线粒体等：称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1 mL 试剂一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃离心 30min ，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃, 100 000g，离心 60min ，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1 mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min ，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL ，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

测定操作:

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二在 37℃水浴中预热 30min。

3、空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 蒸馏水、900µL 试剂二、50µL 试剂三和 10µL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记 为 A1 和 A2，△A 空白管=A2-A1。

4.  测定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 粗酶液、900µL 试剂二、50µL 试剂三和 10µL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分别记 为 A3 和 A4，△A 测定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

计算公式:

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义: 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。

NCR 酶活性(nmol/min/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷( Cpr×V 样)  ÷T 

= 529×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

2、按照样本质量计算

活性单位定义: 37℃中，每克样品每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。

NCR 酶活性(nmol/min/g 鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷( W×V 样÷V 样总)÷ T

= 265×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε: 还原型细胞色素 C 摩尔消光系数， 19100L/mol/cm=0.0191L/µmol/cm; d:  比色皿光径，  1cm; V 反总: 反应体系总体积， 1010µL=0.00101L; Cpr: 上清液蛋白质浓度，mg/mL， 需要另外测定; V 样: 加入反应体系中上清液体积，50µL=0.05mL; V 样总: 加入提取液体积， 0.5mL; W: 样本质量，g; T: 反应时间，2min。

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的 4℃ 可保存两天。