红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性测定试剂盒说明书（分光光度法）
货号：LE-1-369

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系,在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物的代谢, 具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型, 与药物代谢的去甲基化 密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用,也可使某些药物经 CYP2B 代谢活化。

测定原理:

ERND 催化红霉素释放甲醛, 通过 Nash 比色测定甲醛含量,  即可计算出 ERND 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机, 超速离心机、可调式移液枪、 1mL  玻璃比色皿、蒸馏水和 冰。

试剂组成和配制:

试剂一：粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加50 mL 蒸馏水溶解。

试剂二：液体×1瓶, 4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加 2.6 mL 蒸馏水, 充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加 2.6 mL 蒸馏水, 充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前, 加蒸馏水 9 mL 充分溶解。

试剂六：液体×1瓶, 4℃保存。

试剂七：液体×1瓶, 4℃保存。

标准液：液体×1瓶, -20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管,加入 10µl 标准液,加990µl 蒸馏水,混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核,线粒体等大分子物质: 称约 0.5g 组织,加入 1mL 试剂一, 冰上充分研磨, 10 000g 4℃离心 30min , 取上清液,转入超速离心管中。

2、粗制微粒体: 100 000g, 4℃,离心 60min , 弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质: 向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一, 盖紧后充分震荡溶解,100 000g 离心 30min ,弃上清液。

4、最终微粒体: 向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL, 充分震荡溶解, 即粗酶液, 待测。该待测液需当天使用。

测定操作:

1、分光光度计预热 30 min 以上,  调节波长到 412 nm, 蒸馏水调零。

2、试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。

3、对照管: 取 1 支 EP 管, 加入 50µL 粗酶液, 850µL 试剂二, 50µL 试剂三, 50µL 蒸馏水, 混匀后置于 37℃水浴保温 30min; 立即加入 175µL 试剂五, 混匀后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175µL 试剂六,  混匀后室温静置 5min; 室温 8000rpm 离心 5min;  取新的 EP 管, 加 入 500µL 上清液, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷却 5min , 于 412nm 测定光吸收, 记为 A 对照管。

4、测定管: 取 1 支 EP 管, 加入 50µL 粗酶液, 850µL 试剂二, 50µL 试剂三, 50µL 试剂四, 混匀后置于 37℃水浴保温 30min; 立即加入 175µL 试剂五, 混匀后置于冰浴中 5min; 取出 后加入 175µL 试剂六,  混匀后室温静置 5min; 室温 8000rpm 离心 5min;  取 1 支新 EP 管,加入 500µL 上清液, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min, 然后取出, 用冷水冷却 5min , 于 412nm 测定光吸收, 记为 A 测定管。

5、标准管：取 1 支 EP 管,加入 500µL 标准品, 500µL 试剂七, 混匀后 60℃水浴 10min , 然后取出, 用冷水冷却 5min, 于 412nm 测定光吸收,记为 A 标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

ERND 活性计算公式:

1、按照蛋白浓度计算:

活性单位定义: 37℃下,每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷( Cpr×V 样)÷T

= 45×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管÷Cpr。

2、按照样本质量计算:

活性单位定义: 37℃下, 每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷( W×V 样)÷T

= 45×( A 测定管 -A 对照管)÷A 标准管÷W

C 标准品: 0.05 mmol/L=50µmol/L; V 标准品: 500µL=0.0005 L; 稀释倍数: V 反总÷V 上清液= ( 50+850 +50+50+175+175) ÷500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白质浓度, mg/mL,  需要另外测 定, 建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒; V 样: 加入粗酶液体积, 50µL=0.05mL; W: 样本质量, g; T: 催化反应时间, 30min。