6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）

注意：正式测定前务必取 2-3  个预期差异较大的样本做预测定。

规格: 50T/48S

产品内容 ：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存（切忌放-20℃）；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；用时每支加 650μL 双蒸水充分溶解备用；

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；用时每支加 650μL 双蒸水充分溶解备用。

产品说明 ：

G6PDH（EC 1. 1. 1.49）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是磷酸戊糖途径的关键

酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化为 6 -磷酸葡萄糖酸内酯，同时将 NADP+还原为 NADPH ，供生物合成 及维持细胞内的还原状态用。因此 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程度上反映出生物体 的生物合成和抗氧化能力。

G6PDH 催化 NADP+还原生成 NADPH ，在 340nm下测定 NADPH 增加速率。

 需自备的仪器和用品 ：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 操作步骤 ：

一、样本的处理

1 、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10min ， 取上清，置冰上待测。

组织：称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2 、血清（浆） 样品：直接检测。

二、测定步骤

紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

1、试剂一置 37℃水浴预热 30 min。

2、工作液配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三以 15：0.2：0.2 比例混合。

3、加样表：

于 340nm 处测定 5min 内吸光值变化，第 0s 吸光值记为 A1 ，第 300s 吸光值记为 A2 。记△A 测定=A2 测定-A1 测定，△A 空白=A2 空白-A1 空白。

三、G6PDH 活力单位的计算：

1 、血清（浆） G6PDH 活力的计算:

单位的定义： 每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/mL）＝[（△A 测定-△A 空白） ÷ （ ε×d）×109×V 反总]÷V 样本÷T

=643×（△A 测定-△A 空白）

2 、组织中 G6PDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义： 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/mg prot）＝[（△A 测定-△A 空白） ÷ （ ε×d）×109×V 反总]÷(V 样本×Cpr)÷T

=643×（△A 测定-△A 空白） ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义： 每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。   G6PDH（U/g  鲜重） ＝[（△A 测定-△A 空白） ÷ （ ε×d）×109×V 反总]÷(W÷V 提取×V 样本)÷T

=643× （△A 测定-△A 空白） ÷W

3 、细菌或细胞中 G6PDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义： 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/mg prot）＝[（△A 测定-△A 空白） ÷ （ ε×d）×109×V 反总]÷(V 样本×Cpr)÷T

=643×（△A 测定-△A 空白） ÷Cpr

（2）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义： 每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/104 cell）=[ （△A 测定-△A 空白） ÷（ε×d）×109×V 反总]÷(V 样本÷V 提取×500)÷T =1.286×（△A 测定-△A 空白）

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm ；d：1 mL 石英比色皿光径，1cm；V 反总： 反应 总体积，0.001L；V 样本： 加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，5min ；V 提取： 加入提取液体 积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万； 109： 单位换算系数，1mol =109nmol 。

注意事项：

1 、实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃水浴放置。

2 、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃ ，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3 、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4 、若样本测定初始值（0s ）大于 0.5 而△A 测定小于 0. 1 ，可将样本稀释后再行测定。