超氧阴离子(Superoxide anion, OFR)试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-162

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物 大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO₂^- ，NO₂^- 在对氨基苯磺酸和 α-萘胺的作用下，生成红 色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据 ΔA 值可以计算样品中  O₂^- 含量，反应式 为 NH₂OH + 2O₂^- + H⁺ → NO₂^-  + H₂O₂ + H₂O。

自备实验用品及仪器

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 20mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。

超氧阴离子提取

1、植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g ，4℃, 离心 20min，取上清 置于冰上待测。。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1  的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g ，4℃,离心 20min ，取上清置于冰上待测。

3、血清或培养液：直接测定。

测定操作表

超氧阴离子含量计算公式

标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027 ，R² =0.9980

1、组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA +0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2 

=148.76×(ΔA +0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44×(ΔA +0.0027)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样×Cpr)×2 

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T 

=7.44×(ΔA+0.0027)÷Cpr

2、细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2 

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T 

=7.44×(ΔA+0.0027)÷细胞数量

3、血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷V 样×2

=148.76×(ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/mL·min）= 148.76×(ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44×(ΔA+0.0027)

V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.9mL；V 样：反应中样品体积，0.5mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2 ： 2分子 O₂^-  参与反应生成 1 分子 NO₂^- 。

注意事项

1、吸光值大于 2 ，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、样品制备好之后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结 果。

3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。