多酚氧化酶（polyphenol oxidase ，PPO）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-167

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶， 能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

测定原理：

PPO 能够催化邻苯二酚产生醌，后者在 525nm有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体，60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体，40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体，10mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）或果汁样本的处理：

按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议取 0.1mL 血清（浆）或果汁加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰 上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 525nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴 10min（酶促反应时间）后，95℃水浴 5min（终止酶促反应）充分混匀，10000g，25℃离心 10min ，取上清，525nm 处检测测定管和对照管吸光度。ΔA=A 测定管-A 对照管。

注意事项：

每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 5min 95℃水浴处理。

煮沸样本的操作：取 300μl 离心上清于 EP 管中，进行 5min 95℃水浴处理。

PPO 活性计算：

1、血清（浆）或果汁 PPO 活性

单位的定义：每分钟每 mL 血清（浆）或果汁在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个酶活力单位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反总÷(V 液× V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=60×ΔA÷V 液

2、组织、细菌或细胞 PPO 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个 酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T

=60×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为一个 酶活力单位。

PPO（U/g  鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=60×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 525nm 处吸光值变化 0.01 为 一个酶活力单位。

PPO（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=0.12×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.08mL；V 液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL；V 样：加 入样本体积，0.18mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样 本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。