多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

产品内容：

提取液： 液体 100mL×1 瓶，4℃保存，用前混匀即可；

试剂一： 液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二： 液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO 能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在 410nm 有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研 钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1 、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清； 按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声 波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3 秒， 间隔 10 秒， 重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10 分钟，取 上清，置冰上待测。

2 、称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1 、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 410nm ，蒸馏水调零。

2 、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）

充分混匀，5000g，常温离心 10min，收集上清， 取 200μL 至微量玻璃比色皿或 96 孔板中，410nm 处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A 测定-A 对照。

注意：每个测定管需要设置一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进 行 5 min 沸水浴处理。

PPO 活性计算：

用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

1.       按样本蛋白浓度计算：

单位的定义： 每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶 活力单位。

PPO（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V 反总÷ （Cpr×V 样） ÷T =60×ΔA÷Cpr

2.       按样本鲜重计算：

单位的定义： 每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单 位。

PPO（U/g  鲜重） =ΔA÷0.01×V 反总÷ （W÷V 样总×V 样） ÷T =60×ΔA÷W

3.       按细菌或细胞数量计算：

单位的定义： 每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一 个酶活力单位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.01×V 反总÷ （500÷V 样总×V 样） ÷T =0. 12×ΔA

用 96 孔板测定的计算公式如下

1.          按样本蛋白浓度计算：

单位的定义： 每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为一个 酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V 反总÷ （Cpr×V 样） ÷T =120×ΔA÷Cpr

2.          按样本鲜重计算：

单位的定义： 每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为一个 酶活力单位。

PPO（U/g  鲜重） =ΔA÷0.005×V 反总÷ （W×V 样÷V 样总） ÷T =120×ΔA÷W

3.          按细菌或细胞数量计算：

单位的定义： 每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为 一个酶活力单位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.005×V 反总÷ （500÷V 样总×V 样） ÷T =0.24×ΔA

V 反总： 反应体系总体积，0.3mL；V 样： 加入反应体系中样本体积，0.05 mL；V 样总： 加入提取 液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞数量，500 万； T：反应时间，10min。

注意事项：不同样本的多酚氧化酶最佳的反应温度略有差别，可在 25-37℃之间进行调节。