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产品名称:肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-210,LE-2-210

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-210

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒

紫外分光光度法

50管/48样

850

LE-2-210

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒

微量法

100管/96样

1600

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒说明书微量法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

C4H 又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,多存在于高等植物、酵母、菌类中,该酶催化肉桂酸羟化作用产生 4-香豆酸盐,是苯丙烷途径中继 L-苯

丙氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。

测定原理:

C4H 催化肉桂酸和 NADP 生成 4-香豆酸盐和NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 生成速率, 即可反映 C4H 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 25 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次) 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1取试剂二一瓶,加入 10mL 试剂一充分溶解混匀,置于 37℃(哺乳动物) 25℃(其它物种)水浴 5min;现配现用(配好后 24h 内用完

(2)在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本和190μL 试剂二,混匀,立即记录340nm处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

C4H 活性计算:

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

96 孔板测定的计算公式如下

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V ÷V 样总)÷T=2.572×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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