肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-210

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

C4H 又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟 化作用产生 4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。

测定原理：

C4H 催化肉桂酸和 NADP 生成 4-香豆酸盐和 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 生成速率， 即可反映 C4H 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）取试剂二一瓶，加入 25mL 试剂一充分溶解混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用（配好后 24h 内用完）；

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2 ，计算ΔA=A2-A1。

C4H 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=643×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

C4H（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d） ×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

= 1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε ：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。