吡咯啉-5-羧酸合成酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-201

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初 始底物不同，分为谷氨酸( Glu)  和鸟氨酸( Orn)  两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物 适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 过程中分解 ATP 生成 ADP 和无机磷，通过钼酸 铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定 P5CS 活性。

需自备的仪器和用品：

可见外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 60 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 6 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 6 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入 25 mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周；

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入 25 mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周；

试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存；

试剂七：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20 倍稀释，即取 0.1mL 试剂七加 1.9mL 蒸馏水 充分混匀。

定磷剂的配制：按 H2O:  试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1  的比例配制，配好的定磷剂应为浅 黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 

样品酶液的制备：

1、组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~10  的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm。

2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）