正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4 ℃保存一周； 

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周； 

试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃避光保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NADP+和 NADPH 的提取：

1、血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 酸性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：

NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：

先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μ L 上清液，加入 500μ L 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样）：

混匀，取 200μ L 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NADP+或 NADPH. NADP+和 NADPH 含量的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（一）NADP+含量的计算
1、血清（浆）中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[4.57× (△A -0.062）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(△A -0.062）
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot）=[ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(△A -0.062）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重）= [ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(△A -0.062）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell）=[ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(△A -0.062）
（二）NADPH 含量的计算
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）=[7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (△A -0.072）
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.2× (△A -0.072）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (△A -0.072）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (△A-0.072）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（一）NADP+含量的计算
1、血清（浆）中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL）=[9.14× (△A -0.062）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 182.8×(△A -0.062）
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot）=[ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 9.14×(△A -0.062）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重）= [ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=18.28×(△A -0.062）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell）=[ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0366×(△A -0.062）
（二）NADPH 含量的计算
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）=[14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 288× (△A -0.072）
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 14.4× (△A -0.072）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=28.8× (△A -0.072）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0576× (△A-0.072）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注意：最低检测限为 1nmol/mL 或 1nmol/g 鲜重 或 0.01nmol/mg prot