产品名称:NADP磷酸酶(NADPase)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:LE-1-344,LE-2-344
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
LE-1-344 |
NADP磷酸酶(NADPase)测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
520 |
LE-2-344 |
NADP磷酸酶(NADPase)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
980 |
NADP 磷酸酶(NADPase)试剂盒说明书(微量法)
测定意义:
NADPase 主要存在于植物组织中,是生物体内唯一催化 NADP+ 降解为 NAD+ 的酶,与 NADK 一起调控 NAD 和 NADP 之间的平衡。
测定原理:
NADPase 能够催化 NADP+ 水解为 NAD+和无机磷的反应, 通过测定无机磷的量来测定 NADPase 活性。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、 台式离心机、可调式移液器、 微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶, 4℃保存。
试剂一:液体 15 mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂 ×4 支,-20℃保存; 用时加入 1 mL 试剂一充分溶解备用,现配现用。
试剂三:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃可保存一周。
试剂四:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃可保存一周。
试剂五:液体 25mL×1 瓶,室温保存。
试剂六:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂六 20 倍稀释,即取 0.5mL 试剂六加 9.5 蒸馏水, 充分混匀。
定磷试剂的配制:按 H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色, 若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染, 定磷剂现用现配。 注意: 配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染。
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1: 5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液), 进行冰浴匀浆。 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
操作步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。
2 、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
120 |
120 |
试剂二 |
40 |
40 |
37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种) 预热 5min
样本 |
40 |
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蒸馏水 |
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40 |
3 、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)
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标准管 |
空白管 |
测定管 |
对照管 |
0.5μmol/ml 标准磷应用液 |
20 |
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蒸馏水 |
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20 |
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上清液 |
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20 |
20 |
定磷试剂 |
200 |
200 |
200 |
200 |
注意事项:
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格,要没有一点磷,若 试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液, 一定要洗得非常干净,要先用洗洁精加水煮,再用自来 水冲,最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管,避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase 酶活性计算:
1、按组织蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷ (V 样×Cpr)÷T=5 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
定义: 每小时每 g 组织 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力 单位。
NADPase (μmol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ×V总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
C 标准管: 标准管浓度, 0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积, 0.2mL;V 样:加入样本体 积, 0.04mL ;V 样总:加入提取液体积, 1mL;T: 反应时间, 0.5 小时; Cpr:样本蛋白 质浓度, mg/mL;W:样本鲜重,g。
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