注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

规格：100T/96S

产品内容：

提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；用时加入 20 mL 提取液溶解；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；用时每支加 275μL 双蒸水充分溶解备用； 

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；用时每支加 275μL 双蒸水充分溶解备用；

产品说明：

ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH 重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应，在 340 nm 下测定 NADPH 浓度的增加。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96 孔板（UV 板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，蒸馏水调零。

2、工作液配制：将试剂一、试剂二、试剂三按 85：1：1 的比例混合。

3、按下表步骤加样：

注意事项：

1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。若初始值A1 大于 0.5 可尝试将酶液用提取液稀释。

2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液 37℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

三、ICDHc 活力单位的计算：

a、按微量石英比色皿计算：

1、血清（浆）ICDHc 活力的计算:

单位的定义：每 mL 血清（浆）在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样本÷T=1608×ΔA

2、组织中 ICDHc 活力的计算:

①. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

②. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V 提取×V 样本) ÷T=1608×ΔA÷W

3、细菌或培养细胞中 ICDHc 活力的计算:

①. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

②. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/104 Cell）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×500)÷T=3.2×ΔA÷Cpr

V 反总：反应总体积，2×10-4L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：石英比色皿光径，1cm；V 样本：加入样本体积，0.01mL；V 提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T：反应时间，2min；500：细菌或细胞密度，104 个/mL。

b、 按石英96 孔板计算：

将上述公式中光径 d-96 孔板光径改为 0.6cm。