丙二醛含量试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-157

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质；后者逐渐分解为一系列复杂的化合 物，其中包括 MDA。通过检测 MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平。

测定原理：

MDA 与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，在 532nm 有最大吸收 峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 与 600nm 下的吸光度的差值计算 MDA 的含量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏 水。

试剂的组成和配置：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

注意事项：

临用前注意试剂一是否完全溶解 ，如未溶解，可以 70℃-90℃加热，并振荡以促进溶解。

MDA 提取：

1 、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提  取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2 、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、吸取 0.6mL  试剂一于 1.5mL 离心管中，再加入 0.2mL 样本,  混匀。

2 、95℃水浴中保温 30min（盖紧，防止水分散失），置于冰浴中冷却， 10000g，25℃, 离心 10min。

3、吸取上清液于 1mL 玻璃比色皿中，测定 532nm 和600nm 处的吸光度，记为 A532 和 A600， ΔA= A532-A600。

MDA 含量计算：

1、血清（浆） 中 MDA 含量的计算：

MDA 含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样

=25.8×ΔA

2、细菌、细胞或动物组织中 MDA 含量计算

（1）按照蛋白浓度计算

MDA 含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)

=25.8× ΔA÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按照样品质量计算

MDA 含量(nmol/g  鲜重)=[ ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)

=25.8×ΔA ÷W

（3）按照细菌或细胞密度计算：

MDA 含量(nmol/10⁴)=[ ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)

=0.0516×ΔA

V 反总：反应体系总体积，  8×10^-4  L；ε：丙二醛摩尔消光系数， 155×10³  L / mol /cm；d：  比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.2 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万。