抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格：100T/96S

产品内容：

试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 3 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H2O2 氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，APX 与AsA 具有一定的负相关性。

APX 催化催化H₂O₂ 氧化AsA，通过测定AsA 氧化速率，来计算得APX 活性。

自备仪器用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约0.1g 样品，加1 mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g   4℃离心20min，取上清液。

二、测定：

1、分光光度计/酶标仪预热30 min 以上，调节波长到 290 nm，用蒸馏水调零。

2、试剂一在25℃中预热30min 以上。

3、空白管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 蒸馏水、140μL 预热的试剂一、20μL 试剂二和20μL 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定10s 和130s 光吸收A1 和A2，△A 空白管=A1-A2。

4、测定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 上清液、140μL 预热的试剂一、20μL 试剂二和 20μL 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和130s 光吸收A3 和A4，△A 测定管=A3-A4。

 三、APX 活性计算：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为1U。

APX(U/mg prot) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T

=1.79×(△A 测定管-△A 空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：每克样品每分钟氧化 1μmol AsA 为1U。

APX(U/g 鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=1.79×(△A 测定管-△A 空白管) ÷W

ε：AsA 在290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103  L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4  L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V 样总：加入试剂一体积，1mL；T：催化反应时间（min）， 2min。

使用96 孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为1U。

APX(U/mg prot) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T

=3×(△A 测定管-△A 空白管) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：每克样品每分钟氧化 1μmol AsA 为1U。

APX(U/g 鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×106÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=3×(△A 测定管-△A 空白管) ÷W

ε：AsA 在290m 处摩尔吸光系数为 2.8×103  L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.6 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4  L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量，g；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V 样总：加入试剂一体积，1mL；T：催化反应时间（min）， 2min。