二胺氧化酶（DAO）检测试剂盒(分光光度法)

货号：LE-1-170

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜 、肺 、肝脏 、 肾脏等） 、植物和微生物中 。催化多胺氧化为 醛 ，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。

测定原理：

DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺  生成氧化型邻联茴香胺，在 460nm 处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO 活性。

试剂组成和配制：

提取液：液体 80ml×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 0.6ml×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 6ml×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 3ml×1 瓶，4℃保存。

自备仪器和用品：

天平 、低温离心机 、可见分光光度计 、 1 ml 玻璃比色皿 、蒸馏水。

粗酶液提取：

1 、组织：按照组织质量（g） ：提取液体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。

2 、细菌 、真菌：按照细胞数量（ 10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细  胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃,   离心 10min，取上清置于冰上待测。

3 、血清等液体：直接测定。

测定步骤：

混匀，37℃水浴 30min， 1ml 玻璃比色皿，对照管调零，测定 A₄₆₀

酶活性计算公式：

1、按样本蛋白浓度计算：

酶活性定义：在 pH7.2 ，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

DAO 活性（nmol/min/mg prot）=[ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ]×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 18×A460÷Cpr

2、按样本质量计算：

酶活性定义：在 pH7.2 ，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义 为一个酶活力单位。

DAO 活性（nmol/min/g）= [ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）÷T

= 18×A460÷W

3、按细胞数量计算：

酶活性定义：在 pH7.2 ，温度为37℃条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量 定义为一个酶活力单位。

DAO 活性（nmol/min/10⁴cell）= [ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T

= 18×A460÷细胞数量

4、按液体体积计算

酶活性定义：在 pH7.2 ，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定 义为一个酶活力单位。

DAO 活性（nmol/min/ml）=[ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反总÷V 样÷T

= 18×A460

ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积， 1ml；V 样：反应中样本体积，0.25ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；T： 反应时间，30min

注意事项：

1、如果 OD 值小于 0.01，适当加大提取用的样本质量； OD 值大于 0.8，粗酶液可适当稀释，或者减少提取用样本量。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。