脱氢酶(DHA) 试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-379

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶，催化底物通过细胞色素系统被氧化，释放的能量供机体使用，是生物体取得能量的一种方式。

测定原理：

在细胞呼吸过程中，氢受体 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈现红色，在波长 485nm 处有最大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 测定其吸光值，即得脱氢酶活性。

试剂的组成和配制：

提取液：液体50ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，使用前加 10ml 试剂二溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。

试剂二：液体20ml×1瓶，4℃保存。

试剂三：甲醇（自备）。

需自备仪器和用品：

筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、冰 、蒸馏水 、甲醇（不允许快递，请用户自备）。

样品处理：

1 、细菌 、真菌：按照细胞数量（ 10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细  胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃,  离心 10min，取上清置于冰上待测。

2 、组织 ：按照组织质量（ g） ：提取液体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃,   离心 20min。

3 、液体 ：直接检测。

测定步骤：

充分混匀，37℃培养 24h

振荡 1h，8000g，25℃,   离心 5min，取 1ml 上清于比色皿，测定 A485，△A=A 测定-A 空白管 。空白 管只要做一管。

脱氢酶活力计算：

标准曲线：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x 为标准品浓度   ( μg/ml） ，y 为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

酶活单位定义：在 37℃时，每 mg 蛋白样品每min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。

DHA ( μg/ min / mg prot）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反总÷（ Cpr×V 样）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：在 37℃时，每克样品每min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。

DHA ( μg/ min /g  鲜重）=(△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷W

3、按液体体积计算

酶活单位定义：在 37℃时，每 ml 样本每min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。

DHA ( μg/ min /ml）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反总÷V 样÷T

= 0.181× (△A+0.0312）

V 反总：反应总体积，1.65ml；V 样：加入反应体系中样本体积，0. 15ml；T：培养时间，1d= 1440min； W：样品质量，g； Cpr：蛋白浓度，mg/ml。

注意事项：

配制好的试剂一避光保存于 4℃, 最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。