亚硝酸还原酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-312

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为 NO 或 NH3 ，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理

亚硝酸还原酶可将 NO₂—还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO₂— 减少，即 540nm 处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL 玻璃比色皿。

试剂的组成和配制

提取液：液体 80mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 12mL 蒸馏水溶解。

试剂三：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）

试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）

试剂五：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1 的比例混合。

酶液提取

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建议

500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g ，4℃离心 10min ，取上清置于冰上待测。

测定操作表

计算公式

标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072 ，R² = 0.9997；x 为标准品浓度 (μmol/mL），y 为吸光值（A 标准管-A 空白管）。

1、按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO₂— 的量为一个酶活力单位。

NiR (μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 标÷（V 样×Cpr）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO₂— 的量为一个酶活力单位。

NiR (μmol/h/g  鲜重）=[A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 标÷（W ×V 样÷V 样总）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷W

3、按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴ 个细胞每小时还原 1μmol NO₂— 的量为一个酶活力单位。

NiR (μmol/h /10⁴ cell）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 标÷（细胞数量 ×V 样÷V 样总）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷细胞数量

V 标：标准液体积，0.2mL；V 样：体系中加入样本体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体 积，1mL；T ：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

注意事项

1、配制好的工作液 3 天内使用完。

2、若吸光值超过 3 ，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以 稀释倍数。

3、严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4、标准曲线线性范围为 0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

4、A 空白管-（A 测定管-A 对照管）线性范围为 0.02-3。