乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-362

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AchE 属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE 催化 Ach 水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）； TNB 在 412nm 处有吸收峰，通过测定 412  nm 吸光度增加速率，计算 AchE 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 2.6mL 试剂一，充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 2.6mL 试剂一，充分震荡溶解。

粗酶液提取：

1、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆 ，8000g 4℃离心 10min，取上清液待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）： 试剂一体积（mL）为  500~1000： 1  的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃,离心 10min， 取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

测定操作：

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3、取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 上清液、800 μL 试剂一、50μL 试剂二和 50  μL 试剂三，迅速混匀，于 412nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A1，第 190s 吸 光值记为 A2 。△A 测定管=A2-A1。

注意：空白管只需测定一次。

AchE 活性计算公式：

1、组织 AchE 活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（Cpr ×V 样）÷T 

= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（W ×V 样÷V 样总）÷T 

= 245×△A÷W

2、细菌、细胞 AchE 活性

活性单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

3、血清 AchE 活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷V 样÷T

=245×△A

ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；V 反总：反应体系总体积（L）， 1 mL=0.001 L； 10⁶： 1mol=1×10⁶μmol；V  样总：加入提取液体积， 1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；W：  样本质量，g；V 样：加入上清液体积（mL）， 0.1 mL；T：反应时间（min），3 min。