柠檬酸（citric acid, CA）含量测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

CA 是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA 是三羧酸循环第一步反应的产物。

测定原理：

酸性条件下，柠檬酸还原 Cr6+生成 Cr3+，在 545nm 处有特征吸收峰；通过测定 545nm 吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备实验用品及仪器：

低温离心机、水浴锅、可调式移枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×2 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 管，－20℃保存。

试剂四：粉剂×1 管，室温保存。临用前配制，加入 2mL 试剂一，充分溶解。

试剂五：液体×1 管，4℃避光保存。

标准品：液体×1 管，250μ mol/L 柠檬酸标准液，4℃保存。

样品中柠檬酸提取：

1. 液体样品中柠檬酸提取：取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

2. 组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

3. 线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心 5min；取上清至另一EP 管中，11000g，4℃离心 10min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）；向沉淀中加试剂二 200μ l，以及试剂三 2μ l，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

4. 细菌、真菌中：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；11000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

测定操作：

1、分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 545 nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置于 30℃水浴中预热 30min。

3、空白管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 蒸馏水，140μ L 试剂一，20μ L 试剂四，20μ L 试剂五，混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为A 空白管。

4、标准管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 标准液，140μ L 试剂一，20μ L 试剂四，20μ L 试剂五，混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为A 标准管。

5、测定管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μ L 上清液，140μ L 试剂一，20μ L 试剂四，20μ L 试剂五，充分混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为A 测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

计算公式：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按液体样品的体积计算

柠檬酸含量（nmol/L）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×样品稀释倍数×V 总

= 2500×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

C 标准液：250μ  mol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一）÷ 0.1 mL样品=10；V 总：1mL。

（2）按组织质量计算

柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V总÷W

= 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W C 标准液：250 μ mol/L；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量，g。

（3）按蛋白含量计算

柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]÷Cpr

= 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr C 标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。

（4）按细胞数量计算

柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V总÷细胞数量

= 250×(A 测定管－A 空白管) ÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量

C 标准液：250 μ mol/L；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；

使用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按液体样品的体积计算

柠檬酸含量（nmol/L）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×样品稀释倍数×V 总

= 2500×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

C 标准液：250μ  mol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一）÷ 0.1 mL样品=10；V 总：1mL。

（2）按组织质量计算

柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V总÷W= 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W C 标准液：250 μ mol/L；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量，g。

（3）按蛋白含量计算

柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]÷Cpr= 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr C 标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。

（4）按细胞数量计算

柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V总÷细胞数量= 250×(A 测定管－A 空白管) ÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量

C 标准液：250 μ mol/L；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；

注意事项：

1、样品处理等过程均需要在冰上进行。

2、试剂四需现配现用，配置好的一周内使用完；

3、试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。

4、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织，使用本公司 BCA 试剂盒进行测定。