柠檬酸（CA）含量测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-212

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 0.1mL×1 支，-20℃保存。

试剂四：粉剂×1 瓶，室温保存。临用前配制，加入 5mL 试剂一，充分溶解。

试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

标准品：液体 1mL×1 支，1mmol/L 柠檬酸标准液，4℃保存； 临用前用水稀释成 250µmol/L 柠 檬酸标准液。

产品说明：

CA 是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。

测定原理：

酸性条件下，柠檬酸还原 Cr⁶⁺ 生成 Cr³⁺，在 545nm 处有特征吸收峰； 通过测定 545nm 吸光值的 增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品中柠檬酸提取：

1、液体样品中柠檬酸提取：取 0. 1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g/min 4℃离心 10min， 取上清液，待测。

2、组织中柠檬酸提取：称约 0. 1g 组织， 加入 1mL 试剂一， 冰上充分研磨， 11000g/min 4℃离心 10min， 取上清液，待测。

3、线粒体中柠檬酸提取：称约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，600g/min ，4℃离心 5min ；取上清至另一 EP 管中，11000g/min ，4℃离心 10min ，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）； 向沉淀中加试剂二 200µL ，以及试剂三 2µL ，充分悬浮溶解，11000g/min ，4℃ 离心 10min ，取上清液，待测。

二、测定步骤：

1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 545 nm ，蒸馏水调零。

2、试剂一置于 30℃水浴中预热 30min 以上。

3、按下表在 1.5mLEP 管中加入相应试剂

三、柠檬酸含量计算：

1、按液体样品的体积计算：

柠檬酸含量（mmol/L）=[C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×F 

=2.5×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

C 标准液：标准品的浓度，250µmol/L=0.25 mmol/L；F：样本稀释倍数， （0. 1 mL 样品+0.9mL

试剂一） ÷0. 1 mL 样品=10。

2、按组织鲜重计算：

柠檬酸含量（ µ mol/g  鲜重） =[C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷W 

= 0.25×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W

C 标准液：标准品的浓度，250 µ mol/L；V 总： 上清液总体积，1.0mL=0.001L；W：样品质量，g。

3、按线粒体蛋白含量计算：

柠檬酸含量（ µmol/mg prot）=[C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)] ×V 样÷ （Cpr×V 样）

=0.25×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)÷Cpr

C 标准液：标准品的浓度，250 µmol/L=0.25µmol/mL；V 样： 加入的样本体积，100µL=0. 1mL； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1、样品处理等过程均需要在冰上进行。

2、试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。

3、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织，使用本公司 BCA 试剂盒进行测定。

4、若反应 30min 后有明显的黑色小颗粒，属于正常现象，需将样本稀释后再测。