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产品名称:柠檬酸(CA)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-212,LE-2-212

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-212

柠檬酸(CA)测试盒

可见分光光度法

50管/48样

350

LE-2-212

柠檬酸(CA)测试盒

微量法

100管/96样

690

柠檬酸(CA)含量测定试剂盒说明书(微量法

测定意义:

CA 是生物体内常见的有机酸,是重要的食品风味物质。此外,CA 是三羧酸循环第一步反应的产物。

测定原理:

酸性条件下,柠檬酸还原 Cr6+生成 Cr3+,在 545nm 处有特征吸收峰;通过测定 545nm 吸光值的增加,即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备实验用品及仪器:

低温离心机、水浴锅、可调式移枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体×2 瓶,4℃保存。

试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体×1 管,-20℃保存。

试剂四:粉剂×1 管,室温保存。临用前配制,加入 2mL 试剂一,充分溶解。

试剂五:液体×1 ,4℃避光保存。

标准品:液体×1 管,250μ mol/L 柠檬酸标准液,4℃保存。

样品中柠檬酸提取:

1. 液体样品中柠檬酸提取:取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。

2. 组织中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。11000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

3. 线粒体中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆,600g/min,4℃离心 5min;取上清至另一EP 管中,11000g,4℃离心 10min,弃上清(此上清液可用于细胞质 CA 含量测定);向沉淀中加试剂二 200μ l,以及试剂三 2μ l,充分悬浮溶解11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。

4. 细菌、真菌中:按照细胞数量(10个):试剂一体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声秒,间隔秒,总时间 3min)11000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

测定操作:

1、分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 545 nm,蒸馏水调零。

2、试剂一置于 30℃水浴中预热 30min。

3、空白管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 蒸馏水140μ L 试剂一20μ L 试剂四20μ L 试剂五,混匀后室温静置 30min, 545nm 测定吸光度,记为空白管。

4、标准管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 标准液140μ L 试剂一20μ L 试剂四20μ L 试剂五,混匀后室温静置 30min, 545nm 测定吸光度,记为标准管。

5、测定管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 上清液140μ L 试剂一20μ L 试剂四20μ L 试剂五,充分混匀后室温静置 30min, 545nm 测定吸光度,记为测定管。

注意:空白管和标准管只需测定一次。

计算公式:

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按液体样品的体积计算

柠檬酸含量(nmol/L)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×样品稀释倍数×V 

= 2500×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

标准液250μ  mol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数:0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一÷ 0.1 mL样品=10;V 1mL。

2、按组织质量计算

柠檬酸含量(nmol/g 鲜重)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×V÷W

= 250×(A 测定管-空白管)÷(A 标准管空白管) ÷W C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;W:样品质量,g。

3、按蛋白含量计算

柠檬酸含量nmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]÷Cpr

= 250×(A 测定管-空白管)÷(A 标准管空白管) ÷Cpr C 标准液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白质含量,mg/mL。

4、按细胞数量计算

柠檬酸含量nmol/104 cell)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×V÷细胞数量

= 250×(A 测定管-A 空白管) ÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数量

标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

1、按液体样品的体积计算

柠檬酸含量(nmol/L)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×样品稀释倍数×V 

= 2500×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

标准液250μ  mol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数:0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一÷ 0.1 mL样品=10;V 1mL。

2、按组织质量计算

柠檬酸含量(nmol/g 鲜重)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×V÷W

= 250×(A 测定管-空白管)÷(A 标准管空白管) ÷W C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;W:样品质量,g。

3、按蛋白含量计算

柠檬酸含量nmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]÷Cpr

= 250×(A 测定管-空白管)÷(A 标准管空白管) ÷Cpr C 标准液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白质含量,mg/mL。

4、按细胞数量计算

柠檬酸含量nmol/104 cell)= [C 标准液×(A 测定管空白管)÷(A 标准管空白管)]×V总÷细胞数量

= 250×(A 测定管-A 空白管) ÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数量

标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;

注意事项:

1、样品处理等过程均需要在冰上进行。

2、试剂四需现配现用,配置好的一周内使用完;

3、试剂五为易致癌物质,实验过程中,需佩戴手套,避免试剂五溅到皮肤上。

4、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定,如需测定蛋白含量,需另取组织,使用本公司 BCA 试剂盒进行测定。


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