琥珀酸脱氢酶（SDH）活性检测试剂盒说明书(可见分光光度法)

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一： 液体 60mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二： 液体 0.6mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三： 液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四： 粉剂×1 瓶，4℃保存； 临用前加入到试剂三中溶解待用；

试剂五： 粉剂×1 瓶，4℃保存； 临用前加入 4mL 双蒸水，用不完的试剂仍 4℃保存；

试剂六： 粉剂×1 瓶，-20℃保存； 临用前加入 3.333mL 双蒸水，用不完的试剂 4℃保存。

产品说明：

SDH （EC 1.3.5. 1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原 2,6-二氯 酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 处具有特征吸收峰，通过 600nm 吸光度的变化，测定 2 ．6-DPIP 的还原速度，代表 SDH 酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰 和蒸馏水。

操作步骤：

一、SDH 的提取

准确称取 0. 1g 组织或收集 500 万细胞， 加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵 匀浆充分研磨，4 ℃ 11000 g 离心 10min ，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤和加样表

1 、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 600nm ，蒸馏水调零。

2 、样本测定

三、SDH 活性的计算

用 1mL 比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义： 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单 位。

SDH 活性（U/mg prot）＝[（ΔA 测定-ΔA 空白） ÷ （ ε×d）×V 反总×109]÷(Cpr×V 样) ÷T ＝1555.556×（ΔA 测定-ΔA 空白） ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义： 每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 SDH 活性（U/g  鲜重） ＝[（ΔA 测定-ΔA 空白） ÷（ε×d）×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T

＝1571. 111×（ΔA 测定-ΔA 空白） ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义： 每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活 性单位。

SDH 活性（U/104 cell）＝[（ΔA 测定-ΔA 空白） ÷(ε×d)×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T ＝3. 142×（ΔA 测定-ΔA 空白）

V 反总： 反应体系总体积，0.98×10-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，21×103L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样： 加入样本体积，0.03 mL；V 样总： 加入试剂一和试剂二体积，1.01 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数， 500 万。

注意事项：

1 、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性失活。

2 、若ΔA 大于 0.5 ，需将酶液用酶提取液稀释，使ΔA 小于 0.5 ，可提高检测灵敏度。