正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容:

提取液：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂 0.1g×3 支，4℃保存。（使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为 10 个样品用量）

试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。（自备） 试剂六：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器:

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿、蒸馏水， 无水乙醇和乙酸乙酯。

操作步骤：

一、样品处理

组织样品：称取约 0.1g 组织样品，加入 1mL 提取液，充分匀浆后于 4℃，5000rpm 离心 10min， 取上清，加入 0.1mL 试剂一，室温放置 10min，4℃，12000rpm 离心 10min，取上清，然后取 20μL 测定蛋白含量，剩余的作为待测样品。

二、测定步骤和操作表

三、计算公式

1、按蛋白浓度计算：

蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）=（OD₃₇₀ 测定管－OD₃₇₀ 空白管）÷（ε×d）×V÷(Cpr×V 样品)

=（OD₃₇₀ 测定管－OD₃₇₀ 空白管）÷4.4÷Cpr；

2、按样本鲜重计算：

蛋白质羰基含量（μmol/g 鲜重）=（OD₃₇₀ 测定管－OD₃₇₀ 空白管）÷（ε×d）×V÷(W×V 样品÷V 提取)

=（OD₃₇₀ 测定管－OD₃₇₀ 空白管）÷4÷W

ε：蛋白质羰基消光系数，22 mL•μmol-1•cm-1；d：比色皿光径，1cm；V：加入试剂六体积，1mL； V 样品：加入样本体积，0.2 mL； V 提取：加入提取液及试剂一体积，1.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。W：样品质量，g。

注意事项：

1、试剂一使用之前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。

2、试剂二见光易分解，反应需严格避光。