测定意义

植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin 循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和 磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐 步转化为蔗糖。

测定原理

磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与 NAD 在 3-磷酸甘油 醛脱氢酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH ，340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异 构酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

酶液提取

①总TPI 酶提取：建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴， 200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10 的比 例（建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃ , 200g 离心 5min ，弃 沉淀，取上清在4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清用于测定胞浆 TPI 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s ，间歇 7s，总时间 1min），然后4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定叶绿体中 TPI 酶活性。

建议测定总TPI 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 TPI， 则按照步骤②提取粗酶液。

测定操作

1、分光光度计预热 30min ，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 600μL 试剂一，100μL 试剂二，100μL 试剂三，100μL 试 剂四，100μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2， △A=A2-A1

计算公式

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷  (ε×d） ×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

TPI（nmol/min /g  鲜重）= ΔA÷  (ε×d） ×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色 皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T ：反应时 间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g