果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-247

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

果糖-1,6 二磷酸酶又称果糖 1,6 二磷酸酯酶，催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无 机磷，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。

测定原理

FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异 构酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm下测定 NADPH 增加速率， 即可计算 FBP 活性。

需自备的仪器和用品

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制

提取液一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 40mL 试剂四充分溶解待用，用不完的试剂4℃ 保存；

试剂二： 液体 18μL×1 瓶，4℃保存； 临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃ 保存；

试剂四： 液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

样本的前处理

1、总 FBP 酶提取： 建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰 浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃ ,  8000g 离心 10min，取上清测定。

2、胞浆和叶绿体 FBP 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比 例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于4℃ ,  200g 离心 5min，弃 沉淀，取上清在 4℃ ,  8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 FBP 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃ ,  8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 FBP 酶活性。

建议测定总 FBP 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBP，则按照步骤②提取粗酶液。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、加样表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时， 在 340 nm波长下记录反应 1min 后吸光度 A1 和反应 6min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

FBP 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=321.5×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP（nmol/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=321.5×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³  L / mol /cm； d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.1  mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。